PCR pro HIV, kvalitativní nebo kvantitativní. PCR testy na HIV: spolehlivost a vlastnosti postupu. Diagnostika HIV pomocí PCR a ELISA: interpretace, spolehlivost výsledků

Řada nemocí, které jsou sexuálně přenosné, je diagnostikována pomocí metod ELISA a PCR.

Při přípravě na vyšetření není vhodné, aby pacienti dva dny jedli tučná jídla. Stejně jako krevní test na viry se vzorky odebírají nalačno, poslední jídlo bylo nejpozději před 8 hodinami. Vyřaďte ze svého jídelníčku smažená jídla a alkohol. Dodržováním těchto jednoduchých požadavků přiblížíte výsledky vyšetření přesnějším.

Seznam zjištěných onemocnění obsahuje:

• lidský papilomavirus (HPV);
• chlamydie;
• herpes (je předepsán další krevní test na herpes);
• ureaplasma;
• mykoplazma;
• kapavka;
• cytomegalovirus;
• trichomoniáza;
• toxoplazmóza.

PCR pro HIV v diagnostice infekce

Vzhledem k tomu, že nejsou známy žádné příznaky charakteristické výlučně pro infekci HIV, pouze na základě stížností pacienta, který aplikoval, není možné infekci HIV rozpoznat.

Testování na HIV se stalo nutností, protože... Současné veřejné mínění o této nemoci je, že AIDS je považováno za rozsudek smrti. Existují případy, kdy člověk po nepravidelném sexuálním styku věnuje zvýšenou pozornost signálům svého těla, nachází a často vymýšlí nové příznaky smrtelné nemoci.

Provádění výzkumu v laboratorních podmínkách je v současnosti jedinou a nejspolehlivější diagnostickou možností (krevní test na HIV). PCR se používá k určení následujících zdravotních problémů:

• potvrdit nebo vyvrátit přítomnost HIV během séronegativního okna;
• s pochybným výsledkem imunoblotu (pro stanovení přesného popisu patologického procesu);
• při stanovení genotypu HIV-1 nebo HIV-2;
• stanovit a sledovat virovou zátěž těla;
• identifikovat HIV status u novorozenců, jejichž matky jsou přenašečkami HIV;
• během krevní transfuze.

Přednost metody PCR v diagnostice infekční nemoci:

Při zjišťování, že osoba žádající o lékařskou péči pacient s pozitivním výsledkem na infekci HIV, začnou provádět hlubší studie pacienta, aby objasnili a objasnili podstatu onemocnění a jeho průběh, stejně jako základ a povahu sekundárních onemocnění, úroveň imunity poškození.

ELISA a PCR analýzy: výzkumné vlastnosti, principy a interpretace

Krev pro analýzu se odebírá ze žíly. Během těhotenství se přísně odebírají vzorky krve na AIDS. Závěry o nepřítomnosti nebo přítomnosti viru imunodeficience v těle pacienta jsou učiněny na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek. ELISA by se neměla provádět ihned po podezření na infekci, ale po nějaké době, aby se v krvi pacienta vytvořily protilátky. Vymizí z různých důvodů od 3 týdnů do 3 měsíců.

Navíc se ukázalo, že výsledek ELISA může být falešně pozitivní i falešně negativní. Při velmi časné diagnóze podezření na infekci, kdy se protilátky proti HIV ještě neobjevily, je výsledek falešně negativní. V takových případech, pro objasnění, musíte po 1-3 měsících znovu otestovat krev na HIV.

Falešně pozitivní výsledek lze naopak získat, když má pacient kromě uvedených chronických infekcí, rakoviny, autoimunitních onemocnění, v jiných situacích jsou možné odchylky od normy. Pokud je tedy výsledek ELISA pozitivní, určitě se znovu zkontroluje pomocí nejcitlivějších metod.

PCR diagnostika je jednou ze současných nejmodernějších metod výzkumu a poměrně často se využívá při identifikaci infekčních onemocnění. DNA diagnostika zahrnuje několik různými způsoby Pro provádění výzkumu je dnes nejoblíbenější metodou polymerázová řetězová reakce neboli PCR.

Tato metoda je založena na nalezení malé části DNA původce dané infekce ve tkáních pro mikrostudii. V tomto případě malá část DNA obsahuje až několik stovek párů DNA, které jsou v přísném pořadí.

Metoda PCR je nejpřesnější, lze ji použít k určení přítomnosti viru bez ohledu na to, zda se protilátky objeví nebo ne. Ale i přes svou přesnost má metoda jednu vážnou nevýhodu, která je způsobena právě její zvýšenou přesností. Je poměrně vysoká pravděpodobnost, že výsledek bude nepravdivý. Proto se v souvislosti s touto metodou a kromě ní používají i další metody pro detekci genetických a antigenních materiálů.

Podstata diagnostiky hepatitidy pomocí PCR

Existuje pět prokázaných virů, které způsobují onemocnění jater. Jde o známé viry hepatitidy A, B, C, D, E. Velmi vzácné jsou případy, kdy je hepatitida způsobena virem Epstein-Barrové, což je vlastně druh oparu. Uvedené viry jsou zástupci různých rodin, což ovlivňuje jejich léčbu v závislosti na typu hepatitidy.

PCR (polymerázová řetězová reakce) je metoda molekulární genetiky, která umožňuje analyzovat jakoukoli krátkou sekvenci DNA (nebo RNA) i ve vzorcích obsahujících pouze nepatrné množství DNA nebo RNA, a tím určit přítomnost/nepřítomnost patogenního patogenu (např. určit například, zda existuje lidský HIV nebo virus hepatitidy B nebo Mycobacterium tuberculosis). PCR se používá k reprodukci/množení/klonování (amplifikaci) vybraných úseků DNA nebo RNA pro analýzu.

Metoda PCR je tak jednoduchá, že ji zvládne i školák)

Dříve amplifikace DNA zahrnovala klonování požadovaných segmentů do bakteriálních expresních vektorů a trvala týdny. Ale teď, když se PCR provádí ve zkumavkách, trvá to jen pár hodin. PCR je vysoce efektivní, takže z DNA lze vytvořit obrovské množství kopií.

Sekvence DNA a korespondence nukleotidů.

Kéž ruka dárce nikdy neselže

Projekt "AIDS.HIV.STD." je nezisková organizace, kterou vytvořili dobrovolní odborníci na HIV/AIDS na vlastní náklady, aby lidem přinesli pravdu a měli jasno před svým profesionálním svědomím. Budeme vděční za jakoukoli pomoc projektu. Budiž vám to tisícinásobně odměněno: DAROVAT .

Navíc PCR používá stejné molekuly, které příroda používá ke kopírování DNA:

• Dva "primery", krátké jednořetězcové sekvence DNA, které jsou syntetizovány tak, aby odpovídaly začátku a konci úseku DNA, který má být zkopírován.
• Enzym zvaný polymeráza, který se pohybuje podél segmentu DNA, čte její kód a sestavuje kopii.
• Hromada bloků DNA, které tato polymeráza potřebuje vytvořit.

To znamená, že PCR je technika, při které se částice DNA (někdy RNA) množí v určitém roztoku nebo na speciálním povrchu, kde se mohou ukládat.

PCR je technika, která umožňuje vědcům najít jehlu v kupce sena a z těchto jehel pak postavit kupku sena.

úkolem PCR jako metody je namnožit (amplifikovat), udělat z nich co nejvíce kopií, aby bylo možné identifikovat, komu mohou patřit (konkrétní osobě, zvířeti nebo patogennímu organismu), i když jsou tam jen stopy přítomnosti DNA/RNA.

PCR amplifikace je však pouze součástí diagnostického testu. Po zesílení, zesílené segmenty je třeba porovnat s jinými nukleotidovými segmenty, ale ze známého zdroje(například konkrétní osoba, zvíře nebo patogenní organismus). Toto srovnání jedinečných segmentů se často provádí umístěním nukleotidových sekvencí vytvořených pomocí PCR vedle známých nukleotidových sekvencí od lidí, patogenů nebo jiných zdrojů ve speciálním gelu.

Když elektrický proud prochází gelem, různé nukleotidové sekvence tvoří pásy, které se podobají "žebříku" podle jejich elektrický náboj a velikost molekul. Toto se nazývá gelová elektroforéza. Migrují na stejné hladiny v gelu, což ukazuje identitu nukleotidových sekvencí. Tato metoda je jedním z nejpopulárnějších testů PCR v pozdní fázi.

Jak PCR funguje?

V roce 1983 vyvinul Kari Mullis základní kroky k amplifikaci sekvencí DNA. On a Michael Smith byli oceněni Nobelova cena za vytvoření PCR v roce 1993.

PCR se provádí v jedné zkumavce s odpovídajícím chemikálie a při určitou teplotu topení.

Jsou vyžadována následující činidla nebo chemikálie:

• Vzorek obsahující nukleotidovou sekvenci (z krve, vlasů, hnisu, kůže atd.).
• DNA primery: Krátká jednovláknová DNA, která je připojena k nukleotidovým sekvencím, která podporuje syntézu komplementárního vlákna nukleotidů.
• DNA polymeráza: Enzym, který, když se DNA naváže na primer, posune fragment DNA dolů a přidá stavební bloky DNA k vytvoření komplementárních párů bází, a tak syntetizuje komplementární nukleotidový řetězec DNA (zavedení tepelně stabilní DNA polymerázy, Taq polymerázy, odvozené z tepelně odolných bakterií, výrazně zlepšuje schopnost PCR).
• Velký přebytek stavebních bloků DNA nazývaných nukleotidy (adenin, thymidin, cytosin a guanin, zkráceně A, T, C a G) v roztoku. Když jsou tyto bloky spojeny dohromady, tvoří nukleotidovou sekvenci nebo jeden řetězec DNA. Když tyto stavební bloky navážou svůj komplementární stavební blok slabými vodíkovými vazbami (například A se bude vázat pouze na T a G se bude vázat pouze na C), vytvoří se komplementární nukleotidová sekvence DNA, která je spojena s původní jednovláknovou DNA. Po dokončení vazby se vytvoří komplementární dvouvláknová DNA ve specifické sekvenci.

Kari Mullis je velmi zajímavý, cool chlap, podívejte se, jak zajímavě mluví o tom, jak přišel s PCR:

Věří v astrologii, ale nevěří, že HIV způsobuje AIDS.)

Polymerázová řetězová reakce pak začíná segmentem DNA ze vzorku, který se umístí do zkumavky obsahující výše uvedená činidla. Roztok se zahřeje na 94 °C. Zahříváním se ruší vodíkové vazby, které umožňují vznik komplementárních řetězců DNA, takže ve směsi existují pouze jednoduché řetězce (toto se nazývá denaturace dvouřetězcové DNA).

Směs se nechá ochladit na 54 °C. Při této teplotě se DNA primery a DNA polymeráza vážou na jednotlivé jednovláknové DNA (to se nazývá DNA annealing). Protože stavebních bloků je ve směsi nadbytek (vysoká koncentrace), polymeráza je využívá k vytvoření nových komplementárních řetězců DNA (nazývaných prodlužování DNA) a tento proces probíhá rychleji při 72 °C. Tento proces vytváří novou dvouvláknovou molekulu DNA z každého z jednotlivých vláken původní molekuly.

Tento cyklus se opakuje přibližně 40krát ve stroji zvaném tepelný cyklovač, který automaticky opakuje cykly zahřívání a chlazení, přičemž množství každé sekvence DNA se zdvojnásobí pokaždé, když je cyklus zahřívání a chlazení dokončen. To, co bylo původně jedním krátkým segmentem DNA, mohlo být po 40 cyklech zdvojení rozšířeno na přibližně 100 miliard kopií.

Kdy je potřeba PCR test?

Test PCR je základem pro řadu testů, které mohou odpovědět na mnoho různých lékařských otázek, které pomáhají lékařům diagnostikovat a léčit pacienty. Například testy PCR mohou detekovat a identifikovat patogenní organismy u pacientů, zejména těch, které se obtížně kultivují (např. HIV a další viry a některé plísně).

Někteří lékaři předepisují testy PCR, které pomáhají diagnostikovat genetická onemocnění, zatímco jiní lékaři používají PCR k detekci biologických vztahů jako např identifikace rodičů dětí. K identifikaci a charakterizaci se také používají PCR testy genetické mutace a přeuspořádání nalezené v určitých rakovinová onemocnění.

PCR testy však byly modifikovány a implementovány mnoha způsoby vědecký výzkum, včetně evoluční biologie, genetických otisků prstů, forenzní vědy a mnoha dalších.

Co je RT-PCR?

PCR s reverzní transkriptázou (RT-PCR) je test PCR, který je určen k detekci a měření množství RNA. Ačkoli počáteční testy PCR amplifikovaly DNA, mnoho virů a dalších biologických složek (jako jsou mitochondrie) používá RNA jako svůj genetický materiál. RT-PCR se liší od běžné PCR tím, že nejprve vezme RNA a přemění řetězec RNA na řetězec DNA. To se provádí v podstatě stejnou metodou pro PCR popsanou výše, kromě použití enzymu zvaného reverzní transkriptáza místo DNA polymerázy.

Reverzní transkriptáza umožňuje přeměnu jednoho řetězce RNA na komplementární řetězec DNA. Jakmile k této reakci dojde, lze k amplifikaci DNA použít rutinní metodu PCR. RT-PCR se používá k detekci a studiu mnoha RNA virů. RT-PCR by neměla být zaměňována s jinou variantou PCR nazývanou real-time PCR.

Real-time PCR je variantou PCR, která umožňuje analýzu amplifikované DNA v rámci obvyklých 40 cyklů postupu. Ačkoli je postup podobný konvenční cyklické PCR, PCR v reálném čase používá fluorescenční barviva připojená k některým stavebním blokům nebo malým nukleotidovým vláknům. V závislosti na použité metodě dochází k fluorescenci, když se tvoří amplifikované řetězce DNA. Množství fluorescence lze měřit během 40 cyklů a umožňuje výzkumníkům měřit konkrétní produkty a jejich množství během amplifikačních cyklů.

To často umožňuje výzkumníkům nebo technikům přeskočit gelovou elektroforézu nebo jiné sekundární postupy potřebné k analýze produktů PCR, a tím poskytnout rychlejší výsledky. Real-time PCR a RT-PCR jsou variacemi nebo modifikacemi původního PCR testu. Existuje však mnohem více možností (alespoň 25), které existují a používají se k řešení konkrétních problémů. Všechny mají různé názvy, jako je montážní PCR, hot start PCR, multiplex PCR, solid-state PCR a mnoho dalších.

Co je to PCR test na HIV?

PCR(polymerázová řetězová reakce) - metoda množení genetického materiálu viru, test, který určuje genetický materiál viru- HIV RNA nebo DNA.

Pokud je virus obsažen v minimálním množství, pak v důsledku reakce toto množství mnohonásobně vzroste. Proto má PCR vysokou diagnostickou hodnotu.

Obvykle se tento test používá k určení HIV v darované krvi nebo pro včasnou detekci HIV v těle před tvorbou specifických protilátek proti HIV. Specifické protilátky jsou detekovány konvenčními testy HIV (ELISA), ale pouze 1-3, zřídka 12 měsíců po infekci. A pomocí PCR můžete dát poměrně přesnou odpověď po 14 dnech s 98% spolehlivostí a dokonce i po 5 dnech, ale pak bude spolehlivost 80%. HIV PCR je drahý a pracnější test než ELISA, takže Ne každý to používá, ale pouze pro speciální indikace (dárci, kteří utrpěli zdravotní nehodu s HIV infikovanou osobou) nebo za poplatek.

Kvalitativní PCR test na HIV— určuje, zda je či není přítomen virus HIV-1/HIV-2, ale neurčuje počet kopií viru (k určení počtu se používá kvantitativní PCR). Vysoce kvalitní PCR se NEDĚLÁ pro ty, kteří mají známou diagnózu infekce HIV. Jeho Dělají se pouze těm, kteří ještě nevědí, zda jsou nakaženi virem HIV nebo ne.

Toto je metoda pro stanovení oblasti komplementární DNA v genomu lymfocytární buňky postižené HIV. Tito. Neurčuje se samotný virus, ale materiál, který virus integruje do buňky. Jeho DNA už bude uložena v jádře buňky, ze kterého se pak bude číst a množit (sama se kopírovat).

Kvantitativní PCR test na HIV

Kvantitativní PCR analýza pro HIV RNA— určuje počet kopií RNA viru v krvi (DNA PCR se používá ke stanovení viru v buňkách, např. u dětí). Provádí se pouze u lidí infikovaných HIV, sledovat léčbu, určit závažnost procesu onemocnění a účinnost léčby.

Za jak dlouho po infekci lze pomocí metody PCR detekovat HIV?

O kolik dní později mohu provést test HIV PCR po kontaktu s HIV pozitivním partnerem?

HIV lze detekovat pomocí PCR 4-14 dní po infekci. Negativní výsledek PCR na HIV je spolehlivý po 14 dnech po rizikovém kontaktu, ale podle současných předpisů je stále vyžadováno testování s pomocí.

Jak se liší DNA PCR od HIV RNA PCR?

RNA běžně používané v kvantitativních testech k posouzení virové zátěže u diagnostikovaných jedinců, například k posouzení účinnosti terapie.

DNA- v mononukleárních buňkách např. pro diagnostiku u dětí, kde mateřské protilátky proti HIV brání použití metody ELISA.

Oba testy mohou být jak kvantitativní, tak kvalitativní.

Oba mohou být použity pro diagnostiku ve zvláštních případech, ale s přihlédnutím ke konkrétním omezením technické parametry systémy, tzn. podle předpisu lékaře.

Může být HIV PCR falešně pozitivní, důvody?

Pokud se to udělá správně: sestra nezamíchala zkumavky, před odběrem krve se podívala do pasu, zkumavku správně označila, napsala správně návod atd. a laboratorní specialista (většinou laboratorní lékař) udělal vše podle pokynů, splnil všechny požadavky laboratorních předpisů (např. biomateriál byl „vykopán“ správně, bez křížové kontaminace (kontaminace) apod.) a byl použit kvalitní testovací systém, PAK MŮŽE být PCR falešně pozitivní pouze ve 2. % případů (je to způsobeno citlivostí použitých testovacích systémů) .

Ale pokud došlo k pochybení ze strany zdravotnického personálu institucí , PAK může být PCR falešně pozitivní ve více než 2 % případů.

Jak se provádí PCR testování na HIV?

Pro testování na HIV PCR metoda Darujte krev ze žíly, nejlépe (ale ne nutně) ráno nalačno.

Kde se mohu nechat otestovat na HIV PCR?

Chcete-li to provést, zadejte „ udělat test HIV PCR" a do žádosti přidejte svou lokalitu a uvidíte organizace, které se zabývají výzkumem PCR ve vaší oblasti.

Například,

Kolik stojí PCR test HIV?

U 1,5-3 tisíce rublů. v závislosti na regionu.

Jaká je spolehlivost výsledků PCR testu na HIV?

Přes 14 dní po infekci je spolehlivost PCR pro HIV 100%, od 4-5 dnů - spolehlivost je 80%.

Jak dlouho trvá provedení testu PCR na HIV?

Technicky 4-6 hodin, ale ve skutečnosti záleží na organizaci laboratoře a většinou je výsledek dán za 2-3 dny.

PCR pro HIV u novorozence

Vzhledem k tomu, že dítě mladší 1,5 roku narozené HIV+ matce si zachovává protilátky proti HIV, není možné pomocí testu ELISA určit, zda je dítě infikováno HIV nebo ne. V této situaci se používá PCR:

• Pokud je pomocí PCR detekován virus u 1měsíčního dítěte, znamená to, že se nakazilo.
• Pokud má dítě negativní PCR v 1-2 měsících a 4-6 měsících, pak za předpokladu, že ho matka nekrmila s sebou mateřské mléko- dítě je zdravé.

Jaký je rozdíl mezi PCR a ELISA?

PCR určuje samotný virus a ELISA určuje reakci těla (ve formě protilátek) na virus.

PCR detekuje přítomnost viru rychleji než ELISA.

HIV PCR je jedním z nejvíce spolehlivé metody stanovení této nebezpečné diagnózy pro lidské zdraví a život. Lékař může doporučit testování každé osobě, která má důvod se domnívat, že je nakažena virem lidské imunodeficience. Pacienti se často ptají, co je podstatou techniky a jaké jsou její výhody a nevýhody.

Kdy a v jakém časovém rámci byste měli navštívit nemocnici, abyste předložili biomateriál k výzkumu?

PCR je diagnostický přístup, který se v klinické medicíně objevil díky molekulární biologie. Právě z tohoto vědního oboru přišel výzkum do medicíny. A začalo se aktivně používat k určování různých diagnóz, včetně infekce HIV.

Každý ví, že každý živý organismus se skládá z DNA a RNA. Polymerázová řetězová reakce je založena na schopnosti těchto nukleových kyselin se samy replikovat.

Je důležité si uvědomit, že PCR je schopna detekovat i malé koncentrace virových částic v krvi. To je způsobeno skutečností, že v biologické tekutině cirkulují „fragmenty“ nukleových kyselin, které jsou zachyceny a rozpoznány speciálním zařízením. To vám umožní stanovit správnou diagnózu, i když k infekci došlo velmi nedávno.

A virové částice ještě neměly čas se v těle pacienta rozmnožit. Přijato od pacienta biologický materiál umístěn ve speciálním reaktoru. Nejčastěji se používá žilní krev.

Speciální komponenty, které interagují s virovými částicemi, výrazně zvyšují počet detekovaných fragmentů. V důsledku toho se fragmenty stanou identifikovatelnými, lze je posoudit a vyvodit závěry o infekci.

Darujte krev ze žíly standardní metodou.

Před návštěvou lékaře nejezte, je lepší přijít ráno. Pokud pacient podstupuje imunostimulační kúru, musí být přerušena dva týdny před testem.

Výhody a nevýhody techniky

Jako každá jiná metoda diagnostiky konkrétního onemocnění má PCR testování řadu výhod a nevýhod. Mezi výhody metody patří:

• nízká pravděpodobnost setkání s falešně negativním nebo falešně pozitivním výsledkem;
• schopnost používat pro výzkum nejen krev, ale i další biologické tekutiny, jako je vaginální výtok, sperma atd. (jak však lékaři poznamenávají, přesnost se může snížit);
• schopnost použít jednou odebraný materiál k diagnostice několika onemocnění najednou;
• rychlost získávání výsledků (pokud je analýza naléhavá, výsledky jsou obdrženy hned následující den);
• schopnost rychle diagnostikovat infekci a podle toho zahájit léčbu onemocnění, čímž se zlepší prognóza;
• bez věkového omezení (odběr krve ze žíly lze provést i u novorozence).

PCR má přirozeně také nevýhody. Patří sem:

• poměrně vysoká cena studie, zejména ve srovnání se základními screeningovými metodami používanými ve většině nemocnic;
• potřeba sofistikovaného vybavení, které je také drahé;
• stále existuje možnost setkat se s falešnými výsledky, pokud technologie pro provádění analýzy, proces odběru krve nebo osoba trpí autoimunitním, nádorovým nebo chronickým infekčním onemocněním.

Testování PCR by samozřejmě mělo být prováděno na doporučení lékaře.

Lékař bude schopen v každém konkrétním případě posoudit, jak spolehlivé výsledky budou. Pokud to lékař považuje za nutné, doporučí pacientovi místo PCR jinou diagnostickou metodu. Nebo po obdržení výsledků doplní diagnostický akční plán o další položku.

Mnoho pacientů se obává otázky, zda všichni lidé podstoupí PCR testování na HIV. Ve skutečnosti není diagnóza nutná pro každého. Existují však skupiny pacientů, kteří občas musí darovat krev na rozbor.

• Předběžná diagnóza

• Pozitivní imunoglobulinový test

Imunoblotting, který dal pozitivní výsledek virus lidské imunodeficience musí být potvrzen pomocí polymerázové řetězové reakce. Udělejte totéž, pokud byla nejprve provedena PCR. Vzájemné doplňování studií téměř zcela eliminuje možnost chyb.

• Kontrola terapie

Pacienti s potvrzeným HIV statusem poměrně pravidelně darují krev pro PCR testování. To je nezbytné pro sledování průběhu léčby a v případě potřeby úpravu terapie.

• Hodnocení bezpečnosti krve

Každá darovaná krev musí být testována pomocí polymerázové řetězové reakce.

Tím se eliminuje přenos infekce HIV prostřednictvím krevní transfuze.

• Posouzení stavu novorozence

Pokud se dítě narodí HIV pozitivní ženě, musí také podstoupit PCR. To je nezbytné pro určení stavu dítěte a vytvoření taktiky pro jeho další řízení.

Spolehlivost studie

Mnoho pacientů je znepokojeno otázkou, jak spolehlivá je polymerázová řetězová reakce, pokud plánují diagnostikovat virus lidské imunodeficience. Nehledě na to, že PCR je jedna z nej moderní techniky, pořád jí nemůžete ani 100% věřit.

Dnes se PCR stále nepoužívá jako screeningová metoda právě proto, že může poskytovat falešně pozitivní výsledky.

Aby se tomu zabránilo, lékaři doporučují řádně se připravit na odběr biomateriálu, ale ani příprava vždy nepomůže. Například test může poskytnout pozitivní výsledek, pokud má osoba v těle zhoubný nádor. Pokud trpí nějakou chronickou infekcí nebo například autoimunitním procesem. I přes možnost získání falešně pozitivního výsledku se PCR v praxi používá jako jedna z nejspolehlivějších metod.

Aby se vyloučily chyby, lékaři často doporučují svým pacientům, aby si test zopakovali, pokud je výsledek pozitivní. V některých případech se také doporučuje dodatečně provést reakci ELISA a další studie. Provedení sady testů vždy poskytuje spolehlivější výsledek než provedení pouze jedné studie.

K čemu lze test použít?

Ne všichni pacienti vědí, k čemu přesně se polymerázová řetězová reakce používá v klinické praxi lékaře.

• Je nutné odhalit onemocnění v latentním období

Virus imunodeficience může v těle existovat latentně po dlouhou dobu.

PCR je jediný test, který může indikovat přítomnost patogenu v těle. I když virových částic je stále velmi málo.

• Stanovení genotypu

Dnes bylo identifikováno několik genotypů infekce HIV. Často je důležité určit, který konkrétní genotyp infikoval osobu, protože na tom závisí výběr antivirových léků.

• Stanovení viru, nikoli protilátek proti němu

Jednou z výhod analýzy je, že tato technika nemůže detekovat protilátky proti virovým částicím, ale samotný virus.

Mnoho pacientů se zajímá o to, proč je to výhoda. Jde o to, že pokud je kladen důraz na detekci samotného patogenu, snižuje se pravděpodobnost setkání s falešně pozitivními reakcemi kvůli podobnosti různých protilátek. Jak lékaři poznamenávají, v mnoha ohledech to byla schopnost detekovat samotný virus, a ne protilátky, díky čemuž byla technika tak účinná.

Kdy je to splatné?

Pacienty často zajímá otázka, jak dlouho trvá návštěva lékaře k darování biologického materiálu.

Vše závisí na tom, co přesně plánujete určit pomocí techniky.

Při podezření na infekci a nutnosti včasné diagnózy se doporučuje pátrat po DNA viru lidské imunodeficience. V průměru začíná být DNA v krvi detekována deset dní po infekci. Doporučuje se však potvrdit analýzu pomocí ELISA, nejprve po 4 týdnech od infekce a poté po 12 týdnech.

Pokud ELISA potvrdí diagnózu, je stav pacienta považován za pozitivní.

Výzkum k určení RNA je vždy kvantitativní. Doporučuje se, pokud je potvrzen pozitivní stav pacienta a je zahájena léčba antivirotiky. Pokud je v těle mnoho RNA, pak je diagnostikována akutní fáze onemocnění. Pokud to nestačí, má se za to, že potlačení patogenu bylo úspěšné a terapie může být změněna na šetrnější.

• Hodnocení odolnosti

Některé kmeny HIV jsou odolné vůči lékům používaným k jejich léčbě. Doporučuje se také studie k posouzení pravděpodobnosti nereagování na léčbu. Provádí se, pokud po předepsání terapie nedojde ke zlepšení. Doporučuje se také během akutního období infekčního procesu.

Virus lidské imunodeficience se v lidské populaci každým rokem šíří aktivněji. S patologií se může setkat každý, a proto je někdy životně důležité vědět, jak stanovit správnou diagnózu.

PCR – dobrá metoda diagnózu, pokud je lékařem správně použita. A hlavní věcí pro pacienta je dodržovat doporučení lékaře pro přípravu na studii, která nejsou komplikovaná.

Jedno z nejzávažnějších onemocnění, které se dosud nepodařilo vyléčit, je způsobeno virem lidské imunodeficience.

Odhalit patogen v těle není snadné: v současnosti se k tomu používá jen několik výzkumných metod.

Jeden takový test je polymerázová řetězová reakce (PCR).

Abyste pochopili metodu polymerázové řetězové reakce, musíte si pamatovat strukturální rysy buněk ze školy.

Žádný živá buňka obsahuje protein a dva typy nukleových kyselin: DNA a RNA. Jsou nejdůležitějšími buněčnými strukturami, protože obsahují speciálním způsobem zakódovanou genetickou informaci.

Kód DNA je striktní sekvence mikrostruktur, které tvoří dlouhý řetězec.

Odkaz! Základem PCR je schopnost nukleové kyseliny se samostatně reprodukovat.

Když virus vstoupí do zdravých buněk, zničí vlákna DNA.

V tomto případě již buňka nebude obsahovat kompletní řetězce, ale pouze malé fragmenty – nukleotidy. Navíc budou viditelné i ty nejmenší částice viru.

Právě na detekci poškozených řetězců DNA a reziduálních buněk je založena metoda polymerázové řetězové reakce.

Existují dva typy diagnostiky PCR:

• Vysoká kvalita. Vhodné pro ty, jejichž diagnóza nebyla potvrzena: jednoduše ukáže, zda je virus v buňkách přítomen.
• Kvantitativní. Pacient obdrží výsledek „Žádná virová DNA detekována“, což znamená nepřítomnost HIV, nebo informaci o přítomnosti patogenu, což znamená, že osoba je infikována HIV.

Pokud je k dispozici potvrzená diagnóza, je předepsána kvantitativní analýza. Slouží ke stanovení počtu kopií RNA (DNA) viru v krvi (buňkách). Kvantitativní analýza umožňuje vyhodnotit účinnost léčby u lidí infikovaných HIV, určit závažnost onemocnění, jeho progresi.

Jaké diagnostické metody mohou detekovat infekci HIV, jsou popsány ve videu:

Výhody a nevýhody této diagnostické metody

Jako každé diagnostické opatření má i PCR svá pro a proti.

Mezi výhody metody patří:

• Vysoká spolehlivost. Pomocí PCR je možné detekovat nejmenší zbytky viru, pravděpodobnost detekce patogenu dosahuje 80 % 4-5 dní po infekci, 100 % 14 dní po infekci. Největší přesnosti je tedy dosaženo při studiu DNA viru v krvinkách: virus lze detekovat, když je jeho počet 1-5 kopií na 1 milion buněk.
• Možnost použití různých biomateriálů(sliny, moč, pot a slzy nejsou pro PCR vhodné, ale lze použít krev, sperma a sekrety pohlavních orgánů od žen).
• Možnost analýzy na různá onemocnění pomocí jednoho vzorku. Pomocí PCR můžete detekovat HIV, chlamydie, herpes, cytomegalovirus, ureaplasma, mykoplasma, kapavka, trichomoniáza, toxoplazmóza.
• Vysoká rychlost získávání výsledků. Existuje rychlý test PCR, který vám umožní zjistit výsledky diagnostiky během několika hodin.
• Vysoká citlivost: PCR na rozdíl např. od ELISA pomáhá detekovat virus v prvních týdnech po infekci.
• Možnost získání výsledků během několika dnů po infekci. Při infekci lze virus určit po 5-14 dnech, zatímco ELISA je vhodné provést až po 6 týdnech.
• Žádné věkové omezení. PCR lze provádět u dospělých i dětí od okamžiku narození.

Hlavním rysem analýzy PCR je, že nedetekuje protilátky proti viru, ale samotný virus.

Existuje jen několik nevýhod proti výhodám:

• Drahý.
• Pravděpodobnost získání falešně pozitivních výsledků je asi 20 %. Obvykle se tak děje vinou personálu (chyby při odběru nebo přepravě biomateriálu, při studiu biomateriálu a dešifrování výsledků).
• Nutnost používat pokročilé high-tech vybavení, kterým jsou vybaveny pouze některé kliniky.

Pozor! Je zřejmé, že metoda má mnohem více výhod než nevýhod. Je obzvláště důležité, aby pomocí PCR bylo možné identifikovat onemocnění v počáteční fázi vývoje a zahájit léčbu včas.

Výsledek PCR testu může být pozitivní již 14-21 dní po případné infekci. Pokud je však test negativní, nezaručuje to nepřítomnost infekce. Po 2 týdnech je lepší provést potvrzující medový test ELISA.

Jak se provádí PCR test na HIV, je popsáno ve videu:

Komu je přidělen?

V první řadě je při podezření na HIV předepsána PCR. Technika může být také orientační pro identifikaci pohlavně přenosných chorob a dědičných chorob.

Odkaz! PCR diagnostika se často provádí z iniciativy osoby, která neprojevila příznaky onemocnění, ale existuje předpoklad a obava z možné infekce, například po nechráněném pohlavním styku, nedávné krevní transfuzi nebo kontaktu s nakaženým. osoba.

Kdo další je k vyšetření indikován?

• Lidé, jejichž test ELISA byl dvakrát pozitivní. PCR umožní stanovit definitivní diagnózu.
• Dárci plánující darovat krev.
• Lidé, u kterých imunobloting potvrdil diagnózu. Imunoblotting je metoda pro diagnostiku AIDS a obvykle se provádí ve spojení s PCR.
• Lidé podstupující léčbu nemocí způsobených HIV. PCR umožňuje vyhodnotit účinnost terapie.
• Novorozenci, jejichž matka je HIV pozitivní (k přenosu viru dochází přibližně ve 30 % případů). Již 2-3 týdny po porodu je možné určit, zda došlo k infekci.

Někteří lidé jsou testováni pro preventivní účely, ale to se nestává často, protože náklady na testování PCR jsou vysoké.

Jak dlouho analýza trvá a kde ji mohu provést?

Analýza HIV PCR se provádí v laboratorním prostředí.

Samotný odběr krve trvá 5-10 minut a výsledky jsou hotové do druhého dne.

Při volbě expresní diagnostiky (například v laboratořích Invitro nebo Hemotest) trvá interpretace výsledků specialistou pouze 2 hodiny.

V soukromých klinikách může být diagnostika provedena anonymně, pokud je to žádoucí. Chcete-li to provést, musíte o tom informovat při osobní návštěvě: každému pacientovi je přiděleno sériové číslo a je mu umožněn přístup k osobnímu účtu. Pak se člověk může dozvědět výsledky i bez druhé návštěvy laboratoře.

Spolehlivost výsledků PCR testu je popsána ve videu:

Náklady na studium

PCR diagnostika není levná, protože vyžaduje určité pokročilé vybavení a speciální znalosti specialisty.

Zařízení je k dispozici pouze v některých lékařských laboratořích, což umožňuje, aby analýza byla nákladná.

Průměrné náklady na výzkum jsou 3000-5000 rublů. V některých regionech náklady nepřesahují 1500-2000 rublů.

Vzhledem k tomu, že existuje možnost falešně pozitivních a falešně negativních výsledků nebo osoba podala žádost příliš brzy (virus ještě nepoškodil strukturu DNA, ale je již přítomen v těle), může být nutné opakování testu.

Vysoká cena je také způsobena skutečností, že diagnostika vyžaduje řadu komponent:

1. DNA segment (šablona) určený pro amplifikaci;
2. Dva primery;
3. Polymeráza je chemicky aktivní složka, která exponenciálně urychluje nárůst počtu virových částic;
4. deoxyribonukleosid trifosfáty;
5. Nabité částice dvojmocného hořčíku;
6. Speciální řešení, ve kterém se provádí polymerační proces. Tento roztok je navržen tak, aby udržoval vhodnou úroveň kyselosti, koncentrace soli a množství hořčíku v kapalině.

Také studie vyžaduje malé množství vazelíny: obsahuje tuky a vysoká teplota vaří, což chrání zkoumaný vzorek před přehřátím.

Provádění analýzy

Pro analýzu je vhodná krev, sperma a vaginální výtok. Zpravidla, Častěji se používá žilní krev.

Krev se odebírá ráno na lačný žaludek.

Kromě toho se na analýzu musíte připravit:

• 2-3 dny před diagnózou by měla být ze stravy vyloučena tučná jídla.
• Alkohol je vyloučen 1-2 dny před analýzou.
• 2 týdny před testem musíte přestat užívat imunostimulační léky.
• Poslední jídlo by mělo proběhnout nejpozději 8 hodin před darováním krve.

Při odběru krve ze žíly se vnitřní ohyb lokte ošetří speciálním roztokem, poté odborník propíchne kůži, nasadí jehlu žilní stříkačky a odebere potřebné množství krve. Poté se jehla odstraní, oblast se znovu ošetří alkoholem a pacientovi se podá vatový tampon.

Pacient musí dočasně ohnout ruku, aby zastavil krvácení. Pokud se člověk cítí dobře, může jít hned domů. Při závratích, nevolnosti a mdlobách je mu poskytnuta první pomoc.

Výsledný biomateriál umístí laborant do sterilní baňky a odešle na diagnostiku. Specialista mísí naštěpený biologický materiál ve speciálním reaktoru s enzymy, které syntetizují různé infekce.

Pokud je v krvi velmi málo virových částic, při interakci s enzymy se jejich počet prudce zvyšuje: činidla se spojí s DNA viru a duplikují ji.

Analýza se provádí v několika fázích, protože dělení molekul probíhá v geometrickém postupu. Jedna buňka dává 2, 2 4 a tak dále.

Při analýze názorů a recenzí lékařů můžeme s jistotou říci: v současné době je diagnostika PCR nejpřesnější metodou testování infekce HIV.

Odkaz! Pomocí analýzy je možné zjistit přítomnost viru v těle během několika dnů po infekci, i když počet virových struktur je pouze 1-5 jednotek na milion buněk. Neměli bychom však zapomínat na nevýhody metody, například pravděpodobnost získání falešně pozitivních výsledků.

PCR však zůstává jedním z mála testů, které umožňují včasnou diagnostiku onemocnění a zahájení léčby.

V posledních letech Velmi populární se stala metoda detekce genetického materiálu HIV metodami replikace (amplifikace, reprodukce) specifických genových sekvencí, často kombinovaná pod názvem jedné z variant této metody „polymerázová řetězová reakce“ (PCR).

Metoda PCR (polymerázová řetězová reakce) je založena na unikátní nemovitost NK (jak DNA, tak RNA) je schopnost vlastní reprodukce, která je uměle reprodukována in vitro. V tomto případě jsou syntetizovány pouze přísně specifické fragmenty NA.

Etiologickým faktorem infekce HIV jsou viry HIV-1 a HIV-2 (Human Immunodeficiency Viruses) z čeledi Retroviridae. Patogeneze infekce HIV spočívá v infekci buněk s fenotypem CD-4 virem, který je vlastní pomocným T lymfocytům a některým dalším buňkám lidského těla. Přímý cytopatický účinek viru imunodeficience na tyto buňky nakonec vede ke smrti v důsledku aktivace oportunních infekcí nebo rozvoje nádorů.

Laboratorní diagnostika infekce HIV se provádí ve třech směrech:

sérologické diagnostiky markery viru pomocí enzymové imunoanalýzy a metod imunoblotování, která spočívá ve stanovení antigenů a protilátek proti HIV v krevním séru.

stanovení virové NK(provirální DNA nebo RNA) pomocí PCR, a to jak v krvi, tak v krevních buňkách.

studie imunitního stavu(kvantitativní hodnocení CD-4 lymfocytů), které se nejvhodněji provádí průtokovou cytometrií.

Zvláště je třeba poznamenat význam PCR při diagnostice infekce HIV u dětí prvního roku života. Včasná diagnostika HIV infekce u dětí tohoto věku je v zásadě nemožná bez použití PCR. To je způsobeno skutečností, že dítě narozené matce infikované HIV má nutně protilátky proti viru imunodeficience. Není možné rozlišit mateřské a vlastní protilátky proti HIV. U neinfikovaného dítěte jsou tyto protilátky pod vlivem vlastního imunitního systému eliminovány do věku 6-9 měsíců, i když v některých případech mohou kolovat až do 18 měsíců života, maximálně však do tohoto období.

Je třeba poznamenat, že testování PCR má smysl pouze v případě úplného odmítnutí kojení dítě HIV pozitivní matkou od okamžiku narození, protože riziko infekce je poměrně vysoké a je asi 5%.

PCR tedy umožňuje diferenciální diagnostiku stavu HIV u malých dětí. Pokud je tedy pozitivní výsledek PCR na NK viru imunodeficience v prvních 48 hodinách života, došlo k infekci HIV in utero. Pokud je výsledek PCR negativní během prvních 48 hodin, ale stane se pozitivním ve věku 7–14 dnů, došlo k infekci intrapartum.

V současné době umožňuje PCR nejen diagnostiku, ale i sledování léčby HIV infekce stanovením koncentrace RNA v plazmě a také identifikaci kmenů viru imunodeficience rezistentních na chemoterapii. Stanovení „virové zátěže“ v krevní plazmě je nejlepším prognostickým kritériem pro průběh HIV infekce a hodnocení účinnosti antiretrovirové terapie.

Známé modifikace PCR pro diagnostiku infekce HIV dosahují senzitivity pouze 98 %, to znamená, že detekují pouze 98 % vzorků od jedinců infikovaných HIV, což je výrazně méně než při použití ELISA (až 99,9 %). Z tohoto důvodu je nelze použít jako konfirmační testy, protože zjevně poskytnou více falešně negativních výsledků než imunoblot. Technika PCR se v praxi chová jako příliš „citlivá“ na vnější výkyvy a v nešikovných rukou a v nedostatečně vybavených laboratorních podmínkách dává značné množství nespecifických (falešně pozitivních) reakcí. Specifičnost PCR závisí také na výběru ingrediencí v ní použitých, zejména tzv. „primerů“, které by měly napodobovat „sekvence genu HIV“, ale nelze je vždy přesně vybrat. Neúspěšná selekce může vést zejména k tomu, že takové testy mohou s různou úspěšností odhalit různé podtypy HIV-1, například odhalit podtyp B a nedetekovat podtypy A a G atd. Vývoj těchto metod však postupuje rychlým tempem a je možné, že se brzy objeví lepší sady standardních činidel. V praxi musí lékaři brát v úvahu provozní charakteristiky diagnostických testů, které nabízejí, přičemž zpočátku předpokládají, že jejich terénní (praktická) hodnota může být výrazně nižší, než uvádí výrobci.

Teoretickou výhodou PCR je, že dokáže detekovat infekci HIV v inkubačním a časném klinickém období, kdy protilátky ještě nemusí být přítomny. Nemůže však vždy identifikovat infikované osoby později v období infekce. V budoucnu to může být důležité i při snaze diagnostikovat infekci HIV u lidí, kteří dostávají antiretrovirovou terapii, kdy hladina HIV v krvi výrazně klesá. Kombinované použití dvou metod, které by mohlo být východiskem z této situace - ELISA a PCR, bohužel výzkum značně prodraží, zvláště pokud je prováděn v masovém měřítku.

Detekce HIV metodou PCR v krvi je možné ve dvou variantách:

Detekce DNA proviru HIV v mononukleárních buňkách periferní krve;

Detekce HIV RNA v tělesných tekutinách (například plazmě nebo séru).

Teď PCR pro DNA proviru HIV používá se jako diagnostická technika pro přímou diagnostiku infekce HIV v následujících případech:

Během sérologického „okna“. I když byste si měli pamatovat! že citlivost PCR pro HIV provirovou DNA se pohybuje od 96 do 99 %, a proto by i přes vysokou míru citlivosti měla být PCR prováděna buď ve spojení s ELISA, nebo s následným potvrzením pomocí ELISA;

V případě pochybného výsledku IS;

Při vyšetřování dětí narozených matkám infikovaným HIV. Použití PCR v tomto případě umožňuje zkrátit čas potřebný k diagnostice infekce HIV z 18 měsíců na 3-6 měsíců.