Пцр на вич качественный или количественный. ПЦР-исследования на ВИЧ: достоверность и особенности проведения процедуры. Диагностика ВИЧ с помощью ПЦР и ИФА: расшифровка, достоверность результатов

Методами ИФА и ПЦР диагностируется ряд заболеваний, которые передаются половым путем.

При подготовке к обследованию пациентам в течение двух дней нежелательно употреблять жирную еду. Как и анализ крови на вирусы, пробы берутся натощак, последний прием пищи был не позднее 8 часов назад. Исключить из рациона жареное и алкоголь. Соблюдая эти несложные требования, вы приближаете результаты своих обследований к более точным.

В список выявляемых заболеваний входят:

• вирус папилломы человека (ВПЧ);
• хламидии;
• герпес (дополнительно назначается анализ крови на герпес);
• уреаплазма;
• микоплазма;
• гонорея;
• цитомегаловирус;
• трихомониаз;
• токсоплазмоз.

ПЦР на ВИЧ в диагностике на инфекции

В связи с тем, что нет известных симптомов, характерных исключительно для ВИЧ-инфекции, основываясь лишь на жалобах обратившегося пациента, произвести распознавание ВИЧ-инфекции не представляется возможным.

Тестирование на ВИЧ стало необходимостью, т.к. современное мнение общества об этой болезни сводится к тому, что СПИД считают смертельным приговором. Встречались такие случаи, что после нерегулярных сексуальных контактов человек уделяет повышенное внимание сигналам своего организма, находя, а зачастую придумывая все новые признаки смертельной болезни.

Проведение исследования в лабораторных условиях на сегодняшний момент единственный и самый надежный вариант диагностики (анализ крови на ВИЧ). Используют ПЦР для определения следующих проблем со здоровьем:

• для подтверждения или опровержения наличия ВИЧ в период серонегативного окна;
• при сомнительном результате иммуноблота (чтобы установить точное описание патологического процесса);
• при установлении генотипа ВИЧ-1 или ВИЧ-2;
• для установления и наблюдения за вирусной загруженностью организма;
• для выявления ВИЧ-статуса у новорожденных детей, матери которых являются носителями ВИЧ;
• при переливании крови.

Превосходство метода ПЦР при диагностировании инфекционных заболеваний:

При установлении у обратившегося за медицинской помощью пациента утвердительного результата на ВИЧ-инфекции начинают проводить более глубокие исследования больного для выяснения и уточнения характера заболевания и его течения, а также основания и характера вторичных болезней, уровня поражения иммунитета.

Анализы ИФА и ПЦР: особенности исследования, принципы и расшифровка

Кровь для проведения анализа берется из вены. В период беременности заборы крови на СПИД производятся в неукоснительном порядке. Выводы об отсутствии или присутствии в организме больного вируса иммунодефицита производятся по результатам наличия или отсутствия антител. ИФА нужно производить не сразу после подозрения на заражение, а спустя некоторое время, чтобы в крови пациента образовались антитела. Проходит по разным причинам от 3 недель до 3 месяцев.

Кроме того, выявлено, что результат ИФА может быть и ложноположительным и ложноотрицательным. При очень ранней диагностике на предполагаемую инфекцию, когда антитела к ВИЧ еще не появились, получается ложноотрицательный результат. В таких случаях для уточнения нужно пересдать кровь на ВИЧ по прошествии 1-3 месяцев.

Ложноположительный итог, напротив, может быть получен в случае, когда у обратившегося пациента есть хронические инфекции, онкологические болезни, аутоиммунные заболевания, кроме перечисленных возможны отклонения от нормы и в других ситуациях. Поэтому при утвердительном результате ИФА его непременно перепроверяют наиболее восприимчивыми способами.

ПЦР диагностика входит в ряды нынешних наиболее высокотехнологичных способов проведения исследований, достаточно часто используется при выявлении инфекционных заболеваний. Диагностирование ДНК вобрало в себя несколько различных способов проведения исследований, в большей степени популярен сегодня метод полимеразной цепной реакции, или ПЦР.

В основе этого метода лежит нахождение в тканях для микроисследования малой части ДНК возбудителя данной инфекции. При этом малая часть ДНК заключает в себе пары ДНК количеством до нескольких сотен, которые находятся в строгом порядке.

Метод ПЦР является наиболее точным, с его помощью возможно определение наличия вируса вне зависимости от того, появились антитела или нет. Но, несмотря на свою точность, метод имеет один серьезнейший недостаток, который как раз и вызван его повышенной точностью. Существует достаточно высокая вероятность, что результат окажется ложным. Поэтому в связи с этим методом и в дополнение к нему применяют иные способы для обнаружения генного и антигенного материалов.

Сущность диагностики гепатитов при помощи ПЦР

Существует пять доказанных вирусов, вызывающих болезни печени. Это известные вирусы гепатита А, В, С, D, Е. Очень редкими являются случаи, когда гепатит вызывается вирусом Эпштейна-Барр, который на деле является разновидностью герпеса. Перечисленные вирусы являются представителями разных семейств, что отражается на их лечении в зависимости от вида гепатита.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой метод молекулярной генетики, который позволяет анализировать любую короткую последовательность ДНК (или РНК) даже в образцах, содержащих только мельчайшие количества ДНК или РНК, тем самым определив наличие/отсутствие патогенного возбудителя (определить, например есть ли в человеке вирус ВИЧ или гепатита Б или микобактерии туберкулёза). ПЦР используется для воспроизведения/умножения/клонирования (амплификации) выбранных участков ДНК или РНК для анализа.

Метод ПЦР настолько прост, что его может поставить даже школьник)

Раньше амплификация ДНК включала клонирование сегментов, представляющих интерес, в векторы для экспрессии в бактериях и занимала недели. Но теперь, когда ПЦР делается в пробирках, требуется всего несколько часов . ПЦР является высокоэффективной , так что из ДНК может быть сделано огромное количество копий.

Последовательность ДНК и соответствие нуклеотидов.

Да не оскудеет рука дающего

Проект «СПИД.ВИЧ.ЗППП.» — некоммерческий, созданный добровольцами-экспертами в области ВИЧ/СПИДа за счет своих собственных средств, чтобы донести правду людям и быть чистыми перед своей профессиональной совестью. Будем благодарны за любую помощь проекту. Да воздастся Вам в тысячи крат: ПОЖЕРТВОВАТЬ .

Более того, ПЦР использует те же молекулы, которые природа использует для копирования ДНК:

• Два «праймера», коротких одноцепочечных последовательностей ДНК, которые синтезируются так, чтобы соответствовать началу и концу растяжения ДНК, подлежащей копированию.
• Фермент, называемый полимеразой, который перемещается вдоль сегмента ДНК, считывает его код и собирает копию.
• Куча блоков ДНК, которые необходимо сделать этой полимеразе.

То есть ПЦР — это такая техника при которой частицы ДНК (иногда РНК) умножаются в определенном растворе или на специальной поверхности, где они могут быть депонированы.

ПЦР — это метод, с помощью которого учёные могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.

задача ПЦР как метода — умножить (амплифицировать), сделать как можно больше их копий, чтобы можно было идентифицировать кому они могут принадлежать (определенному человеку, животному или патогенному организму), даже если есть только следы наличия ДНК/РНК.

Однако ПЦР-амплификация является лишь частью диагностического теста. После проведения амплификации амплифицированные сегменты необходимо сравнить с другими нуклеотидными сегментами , но уже из известного источника (например, конкретного человека, животного или патогенного организма). Это сравнение уникальных сегментов часто выполняется путем размещения нуклеотидных последовательностей, сгенерированных ПЦР, рядом с известными нуклеотидными последовательностями от людей, патогенов или других источников в специальном геле.

Когда электрический ток проходит через гель, то различные нуклеотидные последовательности образуют полосы, которые напоминают «лестницу» в соответствии с их электрическим зарядом и молекулярным размером. Это называется гель-электрофорез. Они мигрируют на одни и те же уровни в геле, показывая идентичность нуклеотидных последовательностей. Этот метод является одним из самых популярных последних этапов ПЦР-тестов.

Как ПЦР работает?

В 1983 году Кари Муллис разработал основные этапы по амплификации ДНК-последовательностей. Он и Майкл Смит были удостоены Нобелевской премии за создание ПЦР в 1993 году.

ПЦР проводится в одной пробирке с соответствующими химическими веществами и при определенной температуре нагревания.

Необходимы следующие реагенты или химикаты:

• Образец, содержащий нуклеотидную последовательность (из крови, волос, гноя, кожи и т. д.).
• ДНК-праймеры: короткая одноцепочечная ДНК, которая присоединена к нуклеотидным последовательностям, которая способствует синтезу комплементарной цепи нуклеотидов.
• ДНК-полимераза: фермент, который, когда ДНК связывается с праймером, спускается по фрагменту ДНК с добавлением структурных блоков ДНК для образования комплементарных пар оснований и, таким образом, синтезирует комплементарную нуклеотидную цепь ДНК (введение термостойкой ДНК-полимеразы, Taq-полимеразы, полученной из термостойких бактерий, заметно улучшает способность к ПЦР).
• Большой избыток структурных блоков ДНК, называемых нуклеотидами (аденин, тимидин, цитозин и гуанин, сокращенные как: A, T, C и G соответственно) в растворе. Когда эти блоки соединены вместе, они образуют нуклеотидную последовательность или одну нить ДНК. Когда эти строительные блоки связывают свой комплементарный строительный блок слабыми водородными связями (например, A будет связываться только с T и G только с C) образуется комплементарная нуклеотидная последовательность ДНК, которая связана с исходной одноцепочечной ДНК. Когда связывание завершается, комплементарная ДНК с двойной цепью образуется в определенной последовательности.

Кари Муллис очень интересный, прикольный дядечка, посмотрите как он интересно рассказывает, как он придумал ПЦР:

Он верит в астрологию, но не верит, что ВИЧ вызывает СПИД.)

Затем полимеразно-цепная реакция начинается с сегмента ДНК из образца, который помещается в пробирку с указанными выше реагентами. Раствор нагревают до 94°С. Нагревание разрушает водородные связи, которые позволяют образовывать комплементарные цепи ДНК, поэтому в смеси существуют только одиночные нити (это называется денатурацией двухцепочечной ДНК).

Смеси дают остыть до 54°C. При этой температуре ДНК-праймеры и ДНК-полимераза связываются с отдельной одноцепочечной ДНК (это называется отжигом ДНК). Поскольку строительных блоки в избытке (высокая концентрация) в смеси, полимераза использует их для создания новых комплементарных нитей ДНК (называемых расширением ДНК), и этот процесс происходит быстрее при 72°C. Этот процесс создает новую двухцепочечную молекулу ДНК из каждой из одиночных нитей исходной молекулы.

Этот цикл повторяется примерно 40 раз в машине, называемой термическим циклером (термосайклером), который автоматически повторяет циклы нагрева-охлаждения, при этом количество каждой последовательности ДНК удваивается каждый раз, когда цикл нагрева-охлаждения завершается. То, что изначально было одним коротким сегментом ДНК, можно было увеличить до примерно 100 миллиардов копий после 40 циклов удвоения.

Когда необходим тест на ПЦР?

Тест на ПЦР является основой для ряда тестов, которые могут отвечать на многие различные медицинские вопросы, которые помогают врачам диагностировать и лечить пациентов. Например, тесты ПЦР могут обнаруживать и идентифицировать патогенные организмы у пациентов, особенно тех, которые трудно культивировать (например, ВИЧ и другие вирусы и некоторые грибы ).

Одни врачи назначают ПЦР-тесты, чтобы помочь диагностировать генетические заболевания , в то время как другие врачи используют ПЦР для обнаружения биологических родственных отношений, таких как идентификация родителей детей . ПЦР-тесты также используются для идентификации и характеристики генетических мутаций и перегруппировок, обнаруженных при определенных раковых заболеваниях .

Тем не менее, ПЦР-тесты были модифицированы и внедрены во многие аспекты научных исследований, включая эволюционную биологию, генетическую отпечатку пальцев, судебно-медицинские исследования и многие другие.

Что такое ОТ-ПЦР?

Обратно-транскриптазный ПЦР (RT-PCR) — это тест на ПЦР, который предназначен для обнаружения и измерения количества РНК. Хотя первоначальные тесты ПЦР амплифицировали ДНК, многие вирусы и другие биологические компоненты (например, митохондрии) используют РНК в качестве своего генетического материала. RT-PCR отличается от обычной ПЦР сначала взятием РНК и превращением нити РНК в нить ДНК. Это делается по существу тем же самым методом для ПЦР, описанным выше, за исключением использования фермента, называемого обратной транскриптазой, вместо ДНК-полимеразы.

Обратная транскриптаза позволяет перевести одну нить РНК в комплементарную цепь ДНК. Как только эта реакция происходит, рутинный метод ПЦР можно затем использовать для амплификации ДНК. RT-PCR используется для обнаружения и изучения многих РНК-вирусов. RT-PCR не следует путать с другим вариантом ПЦР, называемым ПЦР в реальном времени (реал-тайм).

ПЦР в реальном времени представляет собой вариацию ПЦР, которая позволяет анализировать амплифицированную ДНК в течение обычных 40 циклов процедуры. Хотя процедура аналогична обычной ПЦР с циклированием, ПЦР реального времени использует флуоресцентные красители, прикрепленные к некоторым из строительных блоков или небольших нуклеотидных нитей. В зависимости от используемого метода флуоресценция возникает, когда образуются амплифицированные нити ДНК. Количество флуоресценции можно измерить на протяжении 40 циклов и позволяет исследователям измерять определенные продукты и их количества во время циклов амплификации.

Это часто позволяет исследователям или техническим специалистам пропускать гель-электрофорез или другие вторичные процедуры, необходимые для анализа продуктов ПЦР, тем самым обеспечивая более быстрые результаты. ПЦР в реальном времени и RT-PCR являются вариациями или модификациями исходного теста ПЦР. Тем не менее, существует еще много вариантов (не менее 25), которые существуют и используются для решения конкретных проблем. Все они имеют разные названия, такие как сборка ПЦР, ПЦР с горячим началом, мультиплексная ПЦР, твердотельная ПЦР и многие другие.

Что такое ПЦР анализ на ВИЧ?

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — метод умножения генетического материала вируса, анализ, который определяет генетический материал вируса — РНК или ДНК ВИЧ.

Если вирус содержится в минимальном значении, то в результате реакции это количество многократно увеличивается. Поэтому ПЦР имеет высокое диагностическое значение.

Обычно этот тест используется для определения ВИЧ в донорской крови или для раннего определения наличия ВИЧ в организме до выработки специфических антител к ВИЧ. Специфические антитела определяют обычные тесты на ВИЧ (ИФА), но только через 1-3, редко 12 месяцев после заражения. А с помощью ПЦР можно дать достаточно точный ответ через 14 дней с достоверностью 98% и даже через 5 дней, но тогда достоверность будет 80%. ПЦР на ВИЧ — это дорогой и более трудоемкий анализ, чем ИФА, поэтому его используют не всем подряд , а только по особым показаниям (доноры, пострадавшие от медицинской аварии с ВИЧ-инфицированным) или платно.

Качественный ПЦР анализ на ВИЧ — определяет есть вирус ВИЧ-1/ВИЧ-2 или его нет, но он не определяет количество копий вируса (для определения количества используется количественный ПЦР). Качественный ПЦР НЕ делают тем у кого известен диагноз «ВИЧ-инфекция». Его делают только тем, у кого пока неизвестно — инфицирован он ВИЧ или нет.

Это метод определения комплиментарного участка ДНК в геноме клетки лимфоцита пораженного ВИЧ. Т.е. определяется не сам вирус, а материал, который вирус встраивает в клетку. В ядре клетки уже будет храниться его ДНК из которой он потом будет считываться и размножаться (копировать самого себя).

Количественный ПЦР анализ на ВИЧ

Количественный ПЦР анализ на РНК ВИЧ — определяет количество копий РНК вируса в крови (для определения вируса в клетках используют ПЦР ДНК, например у детей). Делается только у ВИЧ-инфицированных , для контроля лечения, определения выраженности процесса развития болезни, эффективности лечения.

Через сколько времени после заражения можно обнаружить ВИЧ с помощью метода ПЦР?

Через сколько дней можно сдавать ПЦР на ВИЧ после контакта с ВИЧ положительным партнёром?

ВИЧ с помощью ПЦР можно обнаружить через 4-14 дней после заражения. Отрицательный результат ПЦР на ВИЧ достоверен после 14 дней после рискованного контакта, но по действующим нормативам всё равно требуется обследование с помощью .

Чем отличается ПЦР ДНК от ПЦР РНК ВИЧ?

РНК обычно используется в количественных тестах для оценки вирусной нагрузки у диагностированных лиц, например, для оценки эффективности терапии.

ДНК - в мононуклеарных клетках, например, для диагностики у детей, там, где антитела к ВИЧ матерей мешает использовать метод ИФА.

И тот и другой тест могут быть и количественными, и качественными.

И тот, и другой можно в особых случаях применить диагностики, но с учетом конкретных ограничений, которые накладывают технические параметры системы, т.е. по назначению врача.

Может ли ПЦР на ВИЧ быть ложноположительным, причины?

Если всё сделано правильно : медсестра не перепутала пробирки, посмотрела паспорт, прежде, чем делать забор крови, правильно промаркировала пробирку, правильно выписала направление и т.д., а специалист лаборатории (обычно это врач-лаборант) сделал всё согласно инструкции, им были соблюдены все требования лабораторного регламента (например, правильно «расскапал» биоматериал, без перекрестной контаминации (загрязнения) и т.д.) и была использована качественная тест-система, ТО ПЦР ложноположительным быть МОЖЕТ только в 2% случаях (это связано с чувствительностью используемых тест-систем) .

Но если были допущены ошибки со стороны персонала медицинского учреждения, ТО ПЦР может быть ложноположительным, более чем в 2% случаев.

Как сдается ПЦР на ВИЧ?

Для исследования на ВИЧ методом ПЦР сдаётся кровь из вены, желательно (но необязательно) утром натощак.

Где можно сдать анализы на ПЦР ВИЧ?

Для этого нужно ввести в поиск Вашего браузера «сдать пцр вич» и добавить в запрос Ваш населенный пункт и Вы увидите организации, которые занимаются у Вас исследованиями на ПЦР.

Например,

Сколько стоит анализ на ВИЧ методом ПЦР?

Около 1,5-3 тыс. руб. в зависимости от региона.

Какова достоверность результатов ПЦР анализа на ВИЧ?

Через 14 дней после заражения достоверность ПЦР на ВИЧ составляет 100%, с 4-5 дня — достоверность 80%.

Сколько времени делается анализ ПЦР на ВИЧ?

Технически 4-6 часов , но в реальности зависит от организации работы лаборатории и обычно результат выдается через 2-3 дня.

ПЦР на ВИЧ у новорожденного ребенка

Так как у ребёнка до 1,5 лет рожденного от ВИЧ+ матери сохраняются её антитела против ВИЧ, то определить заражен ВИЧ ребенок или нет с помощью ИФА невозможно. В такой ситуации используется ПЦР:

• Если у ребенка возрастом 1 мес с помощью ПЦР обнаружили вирус, значит он заразился.
• Если у ребенка в 1-2 месяца и 4-6 месяцев ПЦР отрицательная, то при условии, что мать не кормила его своим грудным молоком — ребёнок здоров.

В чём разница между ПЦР и ИФА?

ПЦР определяет сам вирус, а ИФА реакцию (в виде антител) организма на вирус.

ПЦР быстрее определяет наличие вируса, чем ИФА.

ПЦР на ВИЧ – один из самых достоверных методов постановки этого опасного для здоровья и жизни человека диагноза. Врач может рекомендовать прохождение исследования любому человеку, у которого есть основания подозревать заражение вирусом иммунодефицита человека. Часто пациенты интересуются, в чем суть методики, и каковы ее преимущества и недостатки.

Когда и в какие сроки стоит посетить больницу, чтобы сдать биоматериал на исследование?

ПЦР – диагностический подход, появившийся в клинической медицине благодаря молекулярной биологии. Именно из этой ветки науки исследование пришло в медицину. И стало активно использоваться для постановки различных диагнозов, включая заражение ВИЧ-инфекцией.

Всем известно, что любой живой организм состоит из ДНК и РНК. Полимеразная цепная реакция основана на способности этих нуклеиновых кислот к самовоспроизведению.

Важно помнить, что ПЦР способна определять даже небольшие концентрации вирусных частиц в крови. Происходит это благодаря тому, что в биологической жидкости циркулируют «обломки» нуклеиновых кислот, которые улавливаются и распознаются специальной аппаратурой. Это позволяет поставить верный диагноз даже в том случае, если заражение произошло совсем недавно.

И вирусные частицы еще не успели размножиться в организме пациента. Полученный от пациента биологический материал помещается в специальный реактор. Чаще всего используется венозная кровь.

Специальные компоненты, взаимодействуя с частицами вируса, многократно увеличивают число обнаруженных фрагментов. В итоге фрагменты становятся определяемыми, их можно оценить и сделать выводы о заражении.

Сдают кровь из вены по стандартной методике.

Перед посещением врача не принимают пищу, приходить лучше с утра. Если пациент проходит курс иммуностимуляции, необходимо прервать его за две недели до анализа.

Плюсы и минусы методики

Как и любой другой метод диагностики той или иной болезни, ПЦР-исследование имеет ряд преимуществ и недостатков. К преимуществам метода относят:

• низкую вероятность столкнуться с ложноотрицательным или ложноположительным итогом;
• возможность использовать для исследования не только кровь, но и другие биологические жидкости, такие как выделения из влагалища, сперма и др. (правда, как отмечают врачи, точность может снижаться);
• возможность использовать единожды взятый материал для диагностики сразу нескольких заболеваний;
• быстроту получения результатов (если анализ срочный, то итоги получают уже на следующий день);
• возможность быстро диагностировать заражение и, соответственно, начать терапию заболевания, улучшив таким образом прогноз;
• отсутствие ограничений по возрасту (забор крови из вены можно выполнить даже новорожденному малышу).

Естественно, недостатки у ПЦР тоже есть. К ним относят:

• немаленькую цену на исследование, особенно в сравнении с базовыми скрининговыми методами, применяемыми в большинстве больниц;
• необходимость наличия сложного оборудования, которое также стоит недешево;
• вероятность все же столкнуться с ложными результатами, если нарушена технология выполнения анализа, процесс забора крови или человек страдает от аутоиммунного, опухолевого или хронического инфекционного заболевания.

Естественно, выполнять ПЦР исследование стоит по рекомендации врача.

Доктор сможет оценить в каждом конкретном случае, насколько достоверными будут результаты. Если врач посчитает это необходимым, он вместо ПЦР посоветует своему пациенту другой метод диагностики. Или после получения результатов дополнит план диагностических мероприятия дополнительным пунктом.

Многих пациентов волнует вопрос о том, всем ли людям делается ПЦР-исследование на ВИЧ. На самом деле диагностика обязательна не для всех. Однако есть группы пациентов, которым изредка приходится сдавать кровь для анализа.

• Предварительная диагностика

• Положительное иммуноглобулиновое исследование

Иммуноблотинг, который дал положительный результат на вирус иммунодефицита человека, обязательно подтверждают с помощью полимеразной цепной реакции. Аналогично поступают, если ПЦР выполнялась первой. Дополнение исследований друг другом почти полностью исключает вероятность ошибок.

• Контроль терапии

Пациенты с подтвержденным ВИЧ-статусом довольно регулярно сдают кровь на ПЦР. Это необходимо, чтобы контролировать ход лечения и, если необходимо, корректировать терапию.

• Оценка безопасности крови

Любая донорская кровь должна быть исследована с помощью полимеразной цепной реакции.

Это исключает передачу ВИЧ-инфекции через переливание крови.

• Оценка статуса новорожденного

Если ребенок рожден от ВИЧ-положительной женщины, ему также обязательно выполняется ПЦР. Это необходимо, чтобы определить статус ребенка и выработать тактику его дальнейшего ведения.

Достоверность исследования

Многих пациентов волнует вопрос о том, насколько достоверна полимеразная цепная реакция в том случае, если планируется диагностировать вирус иммунодефицита человека. Несмотря на то, что ПЦР – это одна из самых современных методик, на все 100% все же нельзя доверять даже ей.

Сегодня ПЦР до сих пор не используется как скрининговый метод именно из-за того, что может давать ложноположительные результаты.

Чтобы избежать этого, врачи рекомендуют правильно готовиться к забору биоматериала, но даже подготовка не всегда помогает. Например, тест может дать положительный результат, если у человека есть злокачественная опухоль в организме. Если он страдает от любой хронической инфекции или, например, аутоиммунного процесса. Даже несмотря на наличие вероятности получить ложноположительный результат, ПЦР используется в практике, как один из самых надежных методов.

Чтобы исключить ошибки, врачи часто рекомендуют своим пациентам сдавать анализ повторно, если результат оказался положительным. Также в ряде случаев рекомендуется дополнительно проводить ИФА реакцию и другие исследования. Выполнение комплекса тестов всегда дает более достоверный результат, чем выполнение только одного исследования.

Для чего можно использовать тест

Далеко не все пациенты знают, для чего конкретно применяется полимеразная цепная реакция в клинической практике врача.

• Необходимо обнаружить заболевание в латентном периоде

Вирус иммунодефицита в течение длительного времени может существовать в организме латентно.

ПЦР – единственное исследование, способное указать на присутствие патогена в организме. Даже в том случае, если вирусных частиц еще совсем мало.

• Установление генотипа

Сегодня выявлено несколько генотипов ВИЧ-инфекции. Часто важно определить, какой конкретно генотип заразил человека, так как от этого зависит подбор противовирусных препаратов.

• Определение именно вируса, а не антител к нему

Одно из преимуществ анализа состоит в том, что с помощью методики можно выявить не антитела к вирусным частицам, а непосредственно сам вирус.

Почему это именно преимущество, интересуются многие пациенты. Дело в том, что если упор делается на обнаружение самого патогена, уменьшается вероятность столкнуться с ложноположительными реакциями из-за схожести различных антител. Как отмечают доктора, во многом именно способность определять сам вирус, а не антитела сделала методику столь эффективной.

В какие сроки сдавать

Часто пациенты интересуются вопросом о том, через сколько можно посетить врача, чтобы сдать биологический материал.

Все зависит от того, что именно планируется определять с помощью методики.

ДНК вируса иммунодефицита человека рекомендуется искать в том случае, если есть подозрение на заражение инфекцией, и необходима ранняя диагностика. В крови ДНК в среднем начинает определяться через десять дней после того, как заражение произошло. Однако анализ рекомендуется подтвердить с помощью ИФА сначала через 4 недели от заражения, а затем через 12 недель.

Если ИФА подтверждает диагноз, статус пациента расценивается, как положительный.

Исследование для определения РНК всегда носит количественный характер. Его рекомендуется проводить в том случае, если положительный статус пациента подтвержден, и начато лечение с помощью противовирусной терапии. Если в организме много РНК, то диагностируется острая фаза заболевания. Если мало – считается, что подавление патогена прошло успешно, и терапия может быть изменена на более щадящую.

• Оценка резистентности

Некоторые штаммы ВИЧ проявляют резистентность к препаратам, используемым для их лечения. Чтобы оценить вероятность отсутствия реакции на лечение, также рекомендуется проводить исследование. Ее выполняют, если после назначения терапии улучшение не наступает. Также она рекомендована в острый период инфекционного процесса.

Вирус иммунодефицита человека с каждым годом распространяется в человеческой популяции все активнее. Столкнуться с патологией может любой человек, а потому иногда жизненно необходимо знать, как правильно поставить диагноз.

ПЦР – хороший метод диагностики, если он правильно используется врачом. А пациенту главное – соблюдать рекомендации доктора по подготовке к исследованию, в которых нет ничего сложного.

Одно из самых серьезных заболеваний, которое до сих пор не научились излечивать, вызывается вирусом иммунодефицита человека.

Обнаружить возбудителя в организме непросто: в настоящее время для этого используется всего несколько исследовательских методов.

Один из таких тестов - полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Чтобы понять суд метода полимеразной цепной реакции, нужно вспомнить особенность строения клеток еще из школьного курса.

Любая живая клетка содержит белок и два типа нуклеиновых кислот: ДНК и РНК. Они являются наиважнейшими клеточными структурами, поскольку содержат генетическую информацию, закодированную специальным образом.

ДНК-код представляет собой строгую последовательность микроструктур, которые образуют длинную цепочку.

Справка! В качестве основы ПЦР используется возможность нуклеиновой кислоты самостоятельно репродуцироваться.

Когда вирус проникает в здоровые клетки, он разрушает цепочки ДНК.

В этом случае клетка уже не будет содержать целостные цепочки, а лишь небольшие фрагменты - нуклеотиды. Кроме этого, даже малейшие частички вируса будут видны.

Именно на обнаружении поврежденных цепей ДНК и остаточных клеток и построен метод полимеразной цепной реакции.

При этом существует две разновидности ПЦР-диагностики:

• Качественная . Подходит тем, у кого диагноз не подтвержден: он просто показывает, присутствует ли вирус в клетках.
• Количественная . Пациент получает результат «ДНК вируса не обнаружено», что означает отсутствие ВИЧ, или же информация о присутствии возбудителя, что означает ВИЧ-инфицирование человека.

Если подтвержденный диагноз имеется, назначается количественный анализ. С его помощью определяется количество копий РНК (ДНК) вируса в крови (клетках). Количественный анализ позволяет оценить эффективность лечения у ВИЧ-инфицированных, определить выраженность заболевания, его прогрессирование.

Какие методы диагностики позволяют выявить ВИЧ-инфекцию рассказывается на видео:

Преимущества и недостатки этого метода диагностики

Как и любое диагностическое мероприятие, ПЦР имеет свои плюсы и минусы.

К преимуществам метода относят:

• Высокая достоверность. При ПЦР удается обнаружить мельчайшие остатки вируса, вероятность обнаружения возбудителя достигает 80% через 4-5 дней после заражения, 100% - через 14 дней после заражения. Так, наибольшая точность достигается при изучении ДНК вируса в клетках крови: можно выявить вирус при его количестве 1-5 копий на 1 миллион клеток.
• Возможность использовать различный биоматериал (для ПЦР не подходит слюна, моча, пот и слезы, но может использоваться кровь, сперма и половые выделения у женщин).
• Возможность проведения анализа на разные заболевания по одной пробе. При помощи ПЦР можно обнаружить ВИЧ, хламидии, герпес, цитомегаловирус, уреаплазму, микоплазму, гонорею, трихомониаз, токсоплазмоз.
• Быстрая скорость получения результатов. Существует экспресс-обследование ПЦР, позволяющая узнать результаты диагностики уже через несколько часов.
• Высокая чувствительность : ПЦР, в отличие от, например, ИФА, помогает обнаружить вирус уже на первых неделях после заражения.
• Возможность получения результатов уже через несколько дней после заражения. При инфицировании определить вирус можно через 5-14 дней, тогда как ИФА целесообразно проводить только через 6 недель.
• Отсутствие возрастных ограничений. ПЦР допустимо проводить и у взрослых, и у детей с момента рождения.

Главной особенностью ПЦР-анализа является то, что он выявляет не антитела к вирусу, а сам вирус.

Против преимуществ выступает всего несколько недостатков:

• Дороговизна.
• Вероятность получения ложноположительных результатов - около 20%. Обычно это случается по вине персонала (ошибки при заборе или транспортировке биоматериала, при изучении биоматериала и расшифровке результатов).
• Необходимость применения передового высокого технологичного оборудования, которым снабжены лишь некоторые клиники.

Внимание! Очевидно, что достоинств у методики гораздо больше, чем недостатков. Особенно важно, что при помощи ПЦР можно выявить заболевание на начальном этапе развития и вовремя начать лечение.

Результат анализа ПЦР может быть положительным уже спустя 14-21 день после возможного инфицирования. Но если анализ отрицательный, это не гарантирует отсутствие инфекции. Лучше провести подтверждающий тест медом ИФА через 2 недели.

О том, как проводится анализ ПЦР на ВИЧ рассказывается на видео:

Кому назначается?

В первую очередь, ПЦР назначается при подозрении на ВИЧ. Методика также может быть показательной для выявления заболеваний, передаваемых половым путем, наследственных заболеваний.

Справка! ПЦР-диагностика часто проводится по инициативе человека, у которого не проявились симптомы заболевания, однако есть предположение и беспокойство о возможном заражении, например, после незащищенного полового акта, недавнего переливания крови, контакта с зараженным человеком.

Кому еще показано проведение обследования?

• Людям, у которых анализ ИФА дважды оказался положительным. ПЦР позволит установить окончательный диагноз.
• Донорам, планирующим сдать кровь.
• Людям, у которых иммуноблоттинг подтвердил диагноз. Иммунный блоттинг - метод диагностики СПИДа, и обычно его проводят совместно с ПЦР.
• Людям, находящимся на этапе лечения заболеваний, вызванных ВИЧ. ПЦР позволяет оценить эффективность терапии.
• Новорожденным, мать которых ВИЧ-положительна (передача вируса происходит примерно в 30% случаев). Уже через 2-3 недели после рождения можно определить, произошло ли заражение.

Некоторые люди проходят обследование в профилактических целях, однако это случается нечасто, поскольку стоимость ПЦР-исследования высока.

Сколько времени делается анализ и где можно его сдать?

Анализ ПЦР на ВИЧ проводится в лабораторных условиях.

Сам забор крови производится за 5-10 минут, а уже на следующий день результаты оказываются готовы.

При выборе экспресс-диагностики (например, в лабораториях «Инвитро» или «Гемотест») расшифровка результатов специалистом занимает всего 2 часа.

В частных клиниках диагностику, по желанию, можно пройти анонимно. Для этого нужно сообщить об этом при личном визите: каждому пациенту присваивается порядковый номер и дается доступ к личному кабинету. Тогда человек может узнать результаты даже без повторного визита в лабораторию.

О достоверности результатов ПЦР исследования рассказывается на видео:

Стоимость исследования

ПЦР-диагностика не из дешевых, поскольку требует наличие определенного передового оборудования, а также особых знаний специалиста.

Оборудование есть лишь в некоторых медицинских лабораториях, что позволяет устанавливать высокую стоимость анализа.

Средняя цена исследования - 3000-5000 рублей. В некоторых регионах стоимость не превышает 1500-2000 рублей.

Поскольку существует вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов, или же человек обратился с запросом слишком рано (вирус еще не нарушил структуру ДНК, но уже присутствует в организме), может потребоваться повторное исследование.

Высокая стоимость обусловлена и тем, что для диагностики требуется ряд компонентов:

1. Отрезок ДНК (матрица), предназначенный для амплификации;
2. Два праймера;
3. Полимераза - химически активный компонент, который ускоряет увеличение количества вирусных частиц в геометрической прогрессии;
4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;
5. Заряженные частицы двухвалентного магния;
6. Специальный раствор, в котором осуществляется процесс полимеризации. Этот раствор предназначен для поддержания подходящего уровня кислотности, концентрации солей, количества магния в жидкости.

Также при исследовании требуется небольшое количество вазелина: он содержит жиры и при высокой температуре закипает, что защищает изучаемый образец от перегрева.

Проведение анализа

Для проведения анализа подходит кровь, сперма и влагалищные выделения. Как правило, чаще используют венозную кровь.

Забор крови производится утром натощак.

Кроме этого, к анализу нужно подготовиться:

• За 2-3 дня до диагностики следует исключить из рациона жирные продукты.
• За 1-2 суток до анализа исключается алкоголь.
• За 2 недели до анализа нужно прекратить прием иммуностимулирующих препаратов.
• Последний прием пищи должен произойти не позднее, чем за 8 часов до сдачи крови.

При заборе крови из вены внутренний сгиб локтя обрабатывается специальным раствором, после чего специалист прокалывает кожу, помещает иглу шприца вены и забирает нужное количество крови. Затем игла изымается, место снова обрабатывается спиртовым средством, пациенту выдается ватка.

Пациент должен на время согнуть руку, чтобы кровь остановилась. Если человек чувствует себя хорошо, он сразу может идти домой. При головокружении, тошноте и обмороке ему оказывают первую помощь.

Полученный биоматериал лаборант помещает в стерильную колбу и отправляет на диагностику. Специалист смешивает расщепленный биологический материал в особом реакторе с ферментами, синтезирующими различные инфекции.

Если в крови присутствует очень мало частиц вируса, при взаимодействии с ферментами их количество резко возрастает: реактивы объединяются с ДНК вируса и дублируют ее.

Анализ производится в несколько этапов, поскольку деление молекул происходит в геометрической прогрессии. Из одной клетки получается 2, из 2 - 4 и так далее.

Анализируя мнение и отзывы докторов, можно с уверенностью сказать: в настоящее время ПЦР-диагностика является наиболее точным методом исследования на ВИЧ-инфекцию.

Справка! С помощью анализа можно установить присутствие вируса в организме уже через несколько дней после заражения, даже если количество вирусных структур составляет всего 1-5 единиц на миллион клеток. Однако не стоит забывать о недостатках метода, например, вероятности получения ложноположительных результатов.

Тем не менее, ПЦР остается одним из немногих анализов, которые позволяют вовремя диагностировать заболевание и приступить к лечению.

В последние годы большой популярностью стал пользоваться метод обнаружения генного материала ВИЧ методами репликации (амплификации, размножения) специфических генных последовательностей, часто объединяемых под названием одного из вариантов этого метода «полимеразная цепная реакция» (ПЦР).

В основе метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК.

Этиологическим фактором ВИЧ-инфекции являются вирусы HIV-1 и HIV-2 (от англ. Human Immunodeficiency Viruses) из семейства Retroviridae. Патогенез ВИЧ-инфекции заключен в инфицировании вирусом клеток с фенотипом CD-4, присущий Т-лимфоцитам хелперам и некоторым другим клеткам организма человека. Прямое цитопатическое воздействие, оказываемое вирусом иммунодефицита на указанные клетки, в конечном итоге приводит к летальному исходу за счет активации оппортунистических инфекций или развития опухолей.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции проводится в трёх направлениях:

серологическая диагностика маркеров вируса методами иммуноферментного анализа и иммуноблотинга, заключающаяся в определении в сыворотки крови антигенов и антител против ВИЧ.

определение вирусной НК (провирусной-ДНК или РНК) методом ПЦР, как в крови, так и в клетках крови.

исследование иммунного статуса (количественная оценка CD-4 лимфоцитов), которая наиболее адекватно осуществляется методом проточной цитофлюориметрии.

Особо необходимо отметить значение ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции у детей первого года жизни. Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции у детей этого возраста в принципе невозможна без применения ПЦР. Это обусловлено тем, что ребёнок, родившийся от ВИЧ-инфицированной матери обязательно имеет антитела к вирусу иммунодефицита. Различить материнские и собственные антитела к ВИЧ не представляется возможным. У неинфицированного ребёнка данные антитела элиминируются под влиянием собственной иммунной системой к возрасту 6-9 месяцев, хотя в отдельных случаях могут циркулировать до 18 месяцев жизни, но не более этого срока.

Необходимо отметить, что обследование методом ПЦР имеет смысл только при полном отказе от грудного вскармливания ребёнка ВИЧ-позитивной матерью с момента рождения, т.к. риск заражения довольно высок и составляет около 5%.

Таким образом, ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику ВИЧ-статуса у детей раннего возраста. Так, если имеет место положительный результат ПЦР на НК вируса иммунодефицита в первые 48 часов жизни, то ВИЧ-инфицирование произошло in utero. Если имеет место отрицательный результат ПЦР в первые 48 часов, но становится положительным в возрасте 7 – 14 дней жизни, то инфицирование произошло intrapartum.

В настоящее время ПЦР позволяет осуществлять не только диагностику, но и мониторинг лечения ВИЧ-инфекции путем определения концентрации РНК в плазме, а также выявления резистентных к химиотерапии штаммов вируса иммунодефицита. Определение “вирусной нагрузки” в плазме крови является наилучшим прогностическим критерием течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности антиретровирусной терапии.

Известные модификации ПЦР для диагностики ВИЧ-инфекции достигают чувствительности лишь в 98%, то есть выявляют лишь 98% проб от ВИЧ инфицированных лиц, что существенно ниже, чем при использовании ИФА (до 99,9%). По этой причине они не могут использоваться и как подтверждающие тесты, так как будут давать заведомо больше ложноотрицательных результатов, чем иммуноблот. Методика ПЦР на практике ведет себя как чересчур «чувствительная» к внешним колебаниям, и в неумелых руках, и в недостаточно хорошо оборудованных лабораторных условиях дает немалое количество неспецифических (ложноположительных) реакций. Специфичность ПЦР также зависит от подбора используемых в ней ингредиентов, в особенности, так называемых «праймеров», которые должны имитировать «генные последовательности ВИЧ», но далеко не всегда могут быть точно подобраны. Неудачный подбор может приводить, в частности, к тому, что такие тесты могут с разным успехом выявлять разные субтипы ВИЧ-1, например, выявлять субтип B и не выявлять субтип A и G т.п. Впрочем, разработка этих методик идет быстрыми темпами и не исключено скорое появление более качественных наборов стандартных реактивов. На практике врачи должны учитывать операционные характеристики предлагаемых им диагностических тестов, изначально предполагая, что их полевая (практическая) ценность может быть существенно ниже заявляемой производителями.

Теоретическое преимущество ПЦР состоит в том, что она способна выявлять ВИЧ-инфекцию в инкубационном и раннем клиническом периоде, когда антител еще может не быть. Однако, она пока не всегда может выявлять инфицированных в более позднем периоде инфекции. Это в будущем, возможно, будет иметь значение и при попытке диагностики ВИЧ-инфекции у лиц, получающих противоретровирусную терапию, когда уровень ВИЧ в крови значительно снижается. Совместное использование двух методик, которое могло бы быть выходом из создавшейся ситуации - ИФА и ПЦР, к сожалению, сделает исследования значительно дороже, тем более, если они осуществляются в массовом масштабе.

Обнаружение ВИЧ методом ПЦР в крови возможно в двух вариантах:

Обнаружение ДНК провируса ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови;

Обнаружение РНК ВИЧ в биологических жидкостях организма (например, в плазме или сыворотке крови).

Сейчас ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностическая методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции в следующих случаях:

В период серологического "окна". Хотя следует помнить! что чувствительность ПЦР на провирусную ДНК ВИЧ колеблется от 96 до 99%, в связи с чем, несмотря на высокие показатели чувствительности, ПЦР следует проводить или совместно с ИФА или с последующим подтверждением ИФА;

В случае сомнительного результата ИБ;

При обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Использование ПЦР в этом случае позволяет сократить сроки постановки диагноза ВИЧ-инфекции с 18 месяцев до 3-6 месяцев.